微生物方法學驗證2015

㈠ 微生物計數方法驗證需要怎麼准備

微生物限度檢查方法學驗證
1、供試品：XXXXX膠囊（批號：XXXXXX）
2、菌種：
菌落計數用菌種：
(1)
枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]
(2)
金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]
(3)
大腸埃希菌[CMCC（B）4]
(4)
白色念珠菌[CMCC
(F)
98001]
控制菌檢查用菌種：
(1)
大腸埃希菌[CMCC（B）4]
(2)
金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]
3、培養基：營養肉湯培養基、改良馬丁培養基、營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、膽鹽乳糖培養基、4-甲基傘形酮葡糖苷培養基（MUG）。
4、預試驗
按照中國葯典2005年版微生物限度檢查法中常規法及培養基稀釋法檢驗，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率均小於70%，本品有抑菌作用。
5、細菌、黴菌及酵母菌計數
按照中國葯典2005年版微生物限度檢查法進行細菌、黴菌及酵母菌計數的方法學驗證試驗及菌落計數。
5.1菌液制備：
(1)
接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至10ml營養肉湯中，35～37℃培養18～24小時，取此培養液1ml加0.9％無菌氯化鈉溶液9ml，採用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5～10-7，使菌數約為50～100cfu/ml。
(2)
接種白色念珠菌的新鮮培養物至10ml改良馬丁培養基中，23～28℃培養24～48小時，取此培養液1ml加0.9％無菌氯化鈉溶液9ml，採用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5～10-7，使菌數約為50～100cfu/ml。
5.2
供試液的制備
取供試品10g，pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液至100ml，振搖，使呈1：10的供試品儲備液。取1：10的供試品儲備液
10ml

㈡ 微生物方法學驗證驗證結果怎麼填寫

微生物限度檢查方法學驗證

1、供試品：XXXXX膠囊（批號：XXXXXX）

2、菌種：

菌落計數用菌種：

(1) 枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]

(2) 金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]

(3) 大腸埃希菌[CMCC（B）4]

(4) 白色念珠菌[CMCC (F) 98001]

控制菌檢查用菌種：

(1) 大腸埃希菌[CMCC（B）4]

(2) 金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]

3、培養基：營養肉湯培養基、改良馬丁培養基、營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、膽鹽乳糖培養基、4-甲基傘形酮葡糖苷培養基（MUG）。

4、預試驗 按照中國葯典2005年版微生物限度檢查法中常規法及培養基稀釋法檢驗，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率均小於70%，本品有抑菌作用。

5、細菌、黴菌及酵母菌計數

按照中國葯典2005年版微生物限度檢查法進行細菌、黴菌及酵母菌計數的方法學驗證試驗及菌落計數。

5.1菌液制備：

(1) 接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至10ml營養肉湯中，35～37℃培養18～24小時，取此培養液1ml加0.9％無菌氯化鈉溶液9ml，採用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5～10-7，使菌數約為50～100cfu/ml。

(2) 接種白色念珠菌的新鮮培養物至10ml改良馬丁培養基中，23～28℃培養24～48小時，取此培養液1ml加0.9％無菌氯化鈉溶液9ml，採用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5～10-7，使菌數約為50～100cfu/ml。

5.2 供試液的制備 取供試品10g，pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液至100ml，振搖，使呈1：10的供試品儲備液。取1：10的供試品儲備液 10ml

㈢ 在2015版微生物限度檢查法的驗證中，驗證實驗用菌種有哪幾種

葯品微生物限度檢查是控制葯品質量的一個重要檢查項目。中國葯典2005年版規定，不同的葯品微生物限度檢查中的細菌數、黴菌及酵母菌數測定、各控制菌的檢查，必須按照經過驗證的方法進行。一些中西葯制劑由於葯品本身的理化性質及抑菌活性，干擾葯品污染的微生物計數測定和控制菌的檢出，帶來檢查結果的不準確性。如在細菌數測定中，低稀釋級的平均平板菌落數低於高稀釋級，呈現細菌的不正常分布，即葯品顯現出干擾或抑菌作用；反映在控制菌檢查中，陽性對照試驗呈陰性反應，其檢驗結果不能反映葯品被微生物污染的真實狀況，得出不準確的結果或假陰性結果。由於2005年版以前的中國葯典，沒有要求對微生物限度檢查中的各項目進行方法學驗證，以至於這類方法學問題越來越多，影響微生物限度檢查結果的准確性。2002年10月～2003年4月我所參加中檢所組織葯品微生物限度檢查方法驗證試驗協作課題。選擇了4種審核檢驗的中西葯制劑品種，其原葯品標准沒有進行微生物限度檢查方法驗證考察，也未見相關文獻報道。為對微生物限度檢查方法進行考察，選用4種代表菌做了微生物計數的菌回收率試驗。根據各品種的要求對控制菌做檢出率測定的研究。得出的結果說明這些葯品微生物限度檢查方法存在的問題，並為該課題提供了試驗數據。

㈣ 微生物方法學驗證需要三批樣品嗎

通常情況就是在其他項目進行檢驗的同時，進行微生物的方法學研究，然後三批樣品微生物全檢。既然是微生物檢查，那就要求樣品是在車間生產的，有一定的環境控制條件下生成的樣品，普通實驗室樣品是達不到要求的。

㈤ 微生物限度檢查方法應該說是「驗證」還是「確認」

微生物限度檢查方法應該說是「驗證」還是「確認」
葯品微生物限度檢查是控制葯品質量的一個重要檢查項目。中國葯典2005年版規定，不同的葯品微生物限度檢查中的細菌數、黴菌及酵母菌數測定、各控制菌的檢查，必須按照經過驗證的方法進行。一些中西葯制劑由於葯品本身的理化性質及抑菌活性，干擾葯品污染的微生物計數測定和控制菌的檢出，帶來檢查結果的不準確性。如在細菌數測定中，低稀釋級的平均平板菌落數低於高稀釋級，呈現細菌的不正常分布，即葯品顯現出干擾或抑菌作用；反映在控制菌檢查中，陽性對照試驗呈陰性反應，其檢驗結果不能反映葯品被微生物污染的真實狀況，得出不準確的結果或假陰性結果。由於2005年版以前的中國葯典，沒有要求對微生物限度檢查中的各項目進行方法學驗證，以至於這類方法學問題越來越多，影響微生物限度檢查結果的准確性。2002年10月～2003年4月我所參加中檢所組織葯品微生物限度檢查方法驗證試驗協作課題。選擇了4種審核檢驗的中西葯制劑品種，其原葯品標准沒有進行微生物限度檢查方法驗證考察，也未見相關文獻報道。為對微生物限度檢查方法進行考察，選用4種代表菌做了微生物計數的菌回收率試驗。根據各品種的要求對控制菌做檢出率測定的研究。得出的結果說明這些葯品微生物限度檢查方法存在的問題，並為該課題提供了試驗數據。

㈥ 原料葯工藝改變需重新進行微生物方法學驗證嗎

微生物限度檢查法系檢查非規定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法.檢查項目包括細菌數、黴菌數、酵母菌數及控制菌檢查. 微生物限度檢查應在環境潔凈度10000級下的局部潔凈度 100級的單向流空氣區域內進行.檢驗全過程必須嚴格遵守無菌操作,防止再污染,防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出.單向流空氣區域、工作檯面及環境應定期按《醫葯工業潔凈室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現行國家標准進行潔凈度驗證. 供試品檢查時,如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活劑,應證明其有效性及對微生物無毒性. 除另有規定外,本檢查法中細菌及控制菌培養溫度為30℃～35℃；黴菌、酵母菌培養溫度為23℃～28℃. 檢驗結果以 1g、1ml、10g、10ml或10cm2 為單位報告,特殊品種可以最小包裝單位報告. 檢驗量檢驗量即一次試驗所用的供試品量（g、ml 或cm2）. 除另有規定外,一般供試品的檢驗量為10g 或10ml；膜劑為100cm2；貴重葯品、微量包裝葯品的檢驗量可以酌減.要求檢查沙門菌的供試品,其檢驗量應增加20g 或20ml（其中10g或10ml用於陽性對照試驗）. 檢驗時,應從2 個以上最小包裝單位中抽取供試品,膜劑還不得少於4 片. 一般應隨機抽取不少於檢驗用量（兩個以上最小包裝單位）的3 倍量供試品. 供試液的制備根據供試品的理化特性與生物學特性,採取適宜的方法制備供試液.供試液制備若需加溫時,應均勻加熱,且溫度不應超過45℃.供試液從制備至加入檢驗用培養基,不得超過1 小時. 除另有規定外,常用的供試液制備方法如下. 1.液體供試品取供試品10ml,加pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液至100ml,混勻,作為1∶10 的供試液.油劑可加入適量的無菌聚山梨酯80 使供試品分散均勻.水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液. 2.固體、半固體或黏稠性供試品取供試品10g,加pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液至100ml,用勻漿儀或其他適宜的方法,混勻,作為1∶10 的供試液.必要時加適量的無菌聚山梨酯80,並置水浴中適當加溫使供試品分散均勻. 3.需用特殊供試液制備方法的供試品 (1)非水溶性供試品方法1 取供試品5g（或5ml）,加至含溶化的（溫度不超過45℃）5g 司盤80、3g 單硬脂酸甘油酯、10g 聚山梨酯80 無菌混合物的燒杯中,用無菌玻棒攪拌成團後,慢慢加入45℃的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液至100ml,邊加邊攪拌,使供試品充分乳化,作為1∶20 的供試液. 方法2 取供試品10g,加至含20ml 無菌十四烷酸異丙酯（採用薄膜過濾法過濾除菌.選用孔徑為0.22μm的脂溶性濾膜,在140℃乾熱滅菌2小時）和無菌玻璃珠的適宜容器中,必要時可增加十四烷酸異丙酯的用量,充分振搖,使供試品溶解.然後加入45℃的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液100ml,振搖5～10 分鍾,萃取,靜置使油水明顯分層,取其水層作為1∶10 的供試液. (2)膜劑供試品取供試品100cm2,剪碎,加100ml 的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液（必要時可增加稀釋液）,浸泡,振搖,作為1∶10 的供試液. (3)腸溶及結腸溶制劑供試品取供試品10g,加pH6.8 無菌磷酸鹽緩沖液（用於腸溶制劑）或pH7.6 無菌磷酸鹽緩沖液（用於結腸溶制劑）至100ml,置45℃水浴中,振搖,使溶解,作為1∶10 的供試液. (4)氣霧劑、噴霧劑供試品取規定量供試品,置冰凍室冷凍約1 小時,取出,迅速消毒供試品開啟部位,用無菌鋼錐在該部位鑽一小孔,放至室溫,並輕輕轉動容器,使拋射劑緩緩全部釋出.用無菌注射器吸出全部葯液,加至適量的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液（若含非水溶性成分,加適量的無菌聚山梨酯80）中,混勻,取相當於10g或10ml 的供試品,再稀釋成1∶10 的供試液. (5)貼劑供試品取規定量供試品,去掉貼劑的保護層,放置在無菌玻璃或塑料片上,粘貼面朝上.用適宜的無菌多孔材料（如無菌紗布）覆蓋貼劑的粘貼面以避免貼劑粘貼在一起.然後將其置於適宜體積並含有表面活性劑（如聚山梨酯80 或卵磷脂）的稀釋劑中,用力振盪至少30 分鍾,製成供試液.貼劑也可以其他適宜的方法制備成供試液. (6)具抑菌活性的供試品當供試品有抑菌活性時,採用下列方法進行處理,以消除供試液的抑菌活性後,再依法檢查.常用的方法如下. ①培養基稀釋法 取規定量的供試液,至較大量的培養基中,使單位體積內的供試品含量減少,至不含抑菌作用.測定細菌、黴菌及酵母菌的菌數時,取同稀釋級的供試液2ml,每1ml 供試液可等量分注多個平皿,傾注瓊脂培養基,混勻,凝固,培養,計數.每1ml 供試液所注的平皿中生長的菌數之和即為1ml的菌落數,計算每1ml 供試液的平均菌落數,按平皿法計數規則報告菌數；控制菌檢查時,可加大增菌培養基的用量. ②離心沉澱法 取一定量的供試液, 500 轉/分鍾離心3 分鍾,取全部上清液混合,用於細菌檢查. ③薄膜過濾法 見細菌、黴菌及酵母菌計數項下的「薄膜過濾法」. ④中和法 凡含汞、砷或防腐劑等具有抑菌作用的供試品,可用適宜的中和劑或滅活劑消除其抑菌成分.中和劑或滅活劑可加在所用的稀釋液或培養基中. 細菌、黴菌及酵母菌計數計數培養基的適用性檢查細菌、黴菌及酵母菌計數用的培養基應進行培養基的適用性檢查,成品培養基、由脫水培養基或按培養基處方配製的培養基均應檢查. 菌種 試驗用菌株的傳代次數不得超過5 代（從菌種保存中心獲得的冷凍乾燥菌種為第0 代）.並採用適宜的菌種保藏技術進行保存,以保證試驗菌株的生物學特性. 大腸埃希菌（Escherichia coli）〔CMCC（B） 44 102〕金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）〔CMCC（B） 26 003〕枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B） 63 501〕白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC（F） 98 001〕黑麴黴（Aspergillus niger）〔CMCC（F） 98 003〕菌液制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基或營養瓊脂培養基中,培養18～24 小時；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基或改良馬丁瓊脂培養基中,培養24～48 小時.上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液製成每1ml 含菌數為50～100cfu 的菌懸液.接種黑麴黴的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基中,培養5～7 天,加入3～5ml 含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80 的0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫.然後,採用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內,用含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80 的0.9%無菌氯化鈉溶液製成每1ml 含孢子數50～100cfu 的孢子懸液. 菌懸液在室溫下放置應在2 小時內使用,若保存在2～8℃可在24 小時內使用.黑麴黴孢子懸液可保存在2～8℃,在驗證過的貯存期內使用. 適用性檢查 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌各50～100cfu,分別注入無菌平皿中,立即傾注營養瓊脂培養基,每株試驗菌平行制備2 個平皿,混勻,凝固,置30～35℃培養48 小時,計數；取白色念珠菌、黑麴黴各50～100cfu,分別注入無菌平皿中,立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基,每株試驗菌平行制備2個平皿,混勻,凝固,置23～28℃培養72 小時,計數；取白色念珠菌50～100cfu,注入無菌平皿中,立即傾注酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基,平行制備2 個平皿,混勻,凝固,置23～28℃培養72 小時,計數.同時,用相應的對照培養基替代被檢培養基進行上述試驗. 結果判定 被檢培養基上的菌落平均數與對照培養基上的菌落平均數的比值大於70%,且菌落形態大小應與對照培養基上的菌落一致,判該培養基的適用性檢查符合規定. 計數方法的驗證當建立產品的微生物限度檢查法時,應進行細菌、黴菌及酵母菌計數方法的驗證,以確認所採用的方法適合於該產品的細菌、黴菌及酵母菌數的測定.若產品的組分或原檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時,計數方法應重新驗證. 驗證時,按供試液的制備和細菌、黴菌及酵母菌計數所規定的方法及下列要求進行.對各試驗菌的回收率應逐一進行驗證. 菌種及菌液制備 同計數培養基的適用性檢查. 驗證方法 驗證試驗至少應進行3 次獨立的平行試驗,並分別計算各試驗菌每次試驗的回收率. （1）試驗組 平皿法計數時,取試驗可能用的最低稀釋級供試液1ml 和50～100 cfu 試驗菌,分別注入平皿中,立即傾注瓊脂培養基,每株試驗菌平行制備2個平皿,按平皿法測定其菌數.薄膜過濾法計數時,取規定量試驗可能用的最低稀釋級供試液,過濾,沖洗,在最後一次的沖洗液中加入50～100cfu 試驗菌,過濾,按薄膜過濾法測定其菌數. （2）菌液組 測定所加的試驗菌數. （3）供試品對照組 取規定量供試液,按菌落計數方法測定供試品本底菌數. （4）稀釋劑對照組 若供試液制備需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾等特殊處理時,應增加稀釋劑對照組,以考察供試液制備過程中微生物受影響的程度.試驗時,可用相應的稀釋液替代供試品,加入試驗菌,使最終菌濃度為每1ml 供試液含50～100cfu,按試驗組的供試液制備方法和菌落計數方法測定其菌數. 結果判斷 在3 次獨立的平行試驗中,稀釋劑對照組的菌回收率（稀釋劑對照組的平均菌落數占菌液組的平均菌落數的百分率）應均不低於70%.若試驗組的菌回收率（試驗組的平均菌落數減去供試品對照組的平均菌落數的值占菌液組的平均菌落數的百分率）均不低於70%,照該供試液制備方法和計數法測定供試品的細菌、黴菌及酵母菌數；若任一次試驗中試驗組的菌回收率低於70%,應採用培養基稀釋法、離心沉澱法、薄膜過濾法、中和法（表1）等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性,並重新進行方法驗證. 表1 常見干擾物的中和劑或滅活方法干擾物 可選用的中和劑或滅活方法 戊二醛 亞硫酸氫鈉 酚類、乙醇、吸附物 稀釋法 醛類 稀釋法、甘氨酸、硫代硫酸鹽 季銨類化合物（QACs）、對羥基苯甲酸酯 卵磷脂、聚山梨酯 汞類制劑 亞硫酸氫納、巰基乙酸鹽、硫代硫酸鹽 雙胍類化合物 卵磷脂 干擾物 可選用的中和劑或滅活方法 干擾物 可選用的中和劑或滅活方法 鹵化物 硫代硫酸鹽 乙二胺四乙酸（EDTA） 鎂或鈣離子 磺胺類 對氨基苯甲酸 ?-內醯胺類抗生素 ?-內醯胺酶 若沒有適宜的方法消除供試品中的抑菌作用,那麼驗證試驗中微生物回收的失敗可看成是因供試品的抗菌活性引起的,同時表明該供試品不能被試驗菌污染.但是,供試品也可能僅對試驗用菌株具有抑製作用,而對其他菌株沒有抑製作用.因此,根據供試品須符合的微生物限度標准和菌數報告規則,在不影響檢驗結果判斷的前提 下,應採用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進行方法驗證試驗.若驗證試驗符合要求,應以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液進行供試品檢驗. 計數方法驗證時,採用上述方法若還存在一株或多株試驗菌的回收率達不到要求,那麼選擇回收情況最接近要求的方法和試驗條件進行供試品的檢驗. 驗證試驗也可與供試品的細菌、黴菌及酵母菌計數同時進行. 供試品檢查計數方法包括平皿法和薄膜過濾法.檢查時,按已驗證的計數方法進行供試品的細菌、黴菌及酵母菌菌數的測定. 按計數方法的驗證試驗確認的程序進行供試液制備.用稀釋液稀釋成1∶10、1∶102、1∶103等稀釋級的供試液. 1.平皿法根據菌數報告規則取相應稀釋級的供試液1ml,置直徑90mm 的無菌平皿中,注入15～20ml 溫度不超過45℃的溶化的營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基或酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基,混勻,凝固,倒置培養.每稀釋級每種培養基至少制備2 個平板. 陰性對照試驗 取試驗用的稀釋液1ml,置無菌平皿中,注入培養基,凝固,倒置培養.每種計數用的培養基各制備2 個平板,均不得有菌生長. 培養和計數 除另有規定外,細菌培養3 天,黴菌、酵母菌培養5 天.逐日觀察菌落生長情況；點計菌落數.必要時,可適當延長培養時間至7 天進行菌落計數並報告.菌落蔓延生長成片的平板不宜計數.點計菌落數後,計算各稀釋級供試液的平均菌落數,按菌數報告規則報告菌數.若同稀釋級兩個平板的菌落平均數不小於15,則兩個平板的菌落數不能相差1 倍或以上. 一般營養瓊脂培養基用於細菌計數；玫瑰紅鈉瓊脂培養基用於黴菌及酵母菌計數；酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基用於酵母菌計數.在特殊情況下,若營養瓊脂培養基上長有黴菌和酵母菌、玫瑰紅鈉瓊脂培養基上長有細菌,則應分別點計黴菌和酵母菌、細菌菌落數.然後將營養瓊脂培養基上的黴菌和酵母菌數或玫瑰紅鈉瓊脂培養基上的細菌數,與玫瑰紅鈉瓊脂培養基中的黴菌和酵母菌數或營養瓊脂培養基中的細菌數進行比較,以菌落數高的培養基中的菌數為計數結果. 含蜂蜜、王漿的液體制劑,用玫瑰紅鈉瓊脂培養基測定黴菌數,用酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基測定酵母菌數,合並計數. 菌數報告規則 細菌、酵母菌宜選取平均菌落數小於300cfu、黴菌宜選取平均菌落數小於100cfu 的稀釋級,作為菌數報告（取兩位有效數字）的依據.以最高的平均菌落數乘以稀釋倍數的值報告1g、1mL 或10cm2 供試品中所含的菌數. 如各稀釋級的平板均無菌落生長,或僅最低稀釋級的平板有菌落生長,但平均菌落數小於1 時,以＜1 乘以最低稀釋倍數的值報告菌數. 2.薄膜過濾法採用薄膜過濾法,濾膜孔徑應不大於0.45μm,直徑一般為50mm,若採用其它直徑的濾膜,沖洗量應進行相應的調整.選擇濾膜材質時應保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留.濾器及濾膜使用前應採用適宜的方法滅菌.使用時,應保證濾膜在過濾前後的完整性.水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜.油類供試品,其濾膜和過濾器在使用前應充分乾燥.為發揮濾膜的最大過濾效率,應注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面.供試液經薄膜過濾後,若需要用沖洗液沖洗濾膜,每張濾膜每次沖洗量不超過100ml,總沖洗量不得超過1000ml,以避免濾膜上的微生物受損傷. 取相當於每張濾膜含1g、1ml 或10cm2 供試品的供試液,加至適量的稀釋劑中,混勻,過濾；若供試品每1g、1ml 或10cm2 所含的菌數較多時,可取適宜稀釋級的供試液1ml 進行試驗.用pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜,沖洗方法和沖洗量同「計數方法的驗證」.沖洗後取出濾膜,菌面朝上貼於營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基或酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基平板上培養.每種培養基至少制備一張濾膜. 陰性對照試驗 取試驗用的稀釋液1ml 照上述薄膜過濾法操作,作為陰性對照.陰性對照不得有菌生長. 培養和計數 培養條件和計數方法同平皿法,每片濾膜上的菌落數應不超過100 個. 菌數報告規則 以相當於1g、1ml 或10cm2 供試品的菌落數報告菌數；若濾膜上無菌落生長,以

㈦ 2015年版陳香露白露片微生物方法學驗證用什麼方法

陳香露白露片葯物是一復方中成葯制劑，由川木香、大黃、石菖蒲、陳皮、甘草、次硝酸鉍、氧化鎂、碳酸氫鈉組成，用於胃潰瘍、糜爛性胃炎、胃酸過多等疾病。
建立陳香露白露片葯物微生物限度檢查方法。方法：根據該樣品的微生物限度標准，按《中國葯典》2005年版一部附錄微生物限度檢查法的驗證試驗指導原則，用委託廠家3個批號的陳香露白露片葯物進行驗證試驗，以考察確定陳香露白露片葯物微生物限度的檢查方法。首先用常規法進行預試驗，初步考察該樣品對試驗菌檢測的影響，然後根據預試驗結果，用離心沉澱集菌法進行再試驗。結果：常規法試驗時，大腸埃希菌、白色念珠菌的回收率均大於70%，而金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的回收率小於70%，控制菌檢查檢出試驗菌。採用離心沉澱集菌法試驗時，可以有效消除抑菌作用，使金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的回收率大於70%。結論：採用離心沉澱集菌法可以有效消除抑菌作用，簡便、准確。

㈧ 15版微生物限度方法學適用性

非無菌產品微生物限度檢查：控制菌檢查法-2015中國葯典
控制菌檢查法系用於在規定的試驗條件下，檢查供試品中是否存在特定的微生物。

當本法用於檢查非無菌制劑及其原、輔料是否符合相應的微生物限度標准時，應按下列規定進行檢驗，包括樣品取樣量和結果判斷等。

本檢查法可採用替代的微生物檢查法，包括自動檢測方法，但必須證明替代方法等效於葯典規定的檢查方法。

供試液制備及實驗環境要求同「非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法」（通則1105）。

如果供試品具有抗菌活性，應盡可能去除或中和。供試品檢查時, 若使用了中和劑或滅活劑，應確認有效性及對微生物無毒性。

供試液制備時如果使用了表面活性劑，應確認其對微生物無毒性以及與所使用中和劑或滅活劑的相容性。

培養基適用性檢查和控制菌檢查方法適用性試驗

供試品控制菌檢查中所使用的培養基應進行適用性檢查。

供試品的控制菌檢查方法應進行方法適用性試驗，以確認所採用的方法適合於該產品的控制菌檢查。

若檢驗程序或產品發生變化可能影響檢驗結果時，控制菌檢查方法應重新進行適用性試驗。

菌種及菌液制備

菌種 試驗用菌株的傳代次數不得超過5 代（從菌種保藏中心獲得的乾燥菌種為第0 代），並採用適宜的菌種保藏技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC（B）26 003〕

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)〔CMCC（B）10 104〕

大腸埃希菌(Escherichia coli)〔CMCC（B）44 102〕

乙型副傷寒沙門菌(Salmonella paratyphi B)〔CMCC（B）50 094〕

白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC（F）98 001〕

生孢梭菌（Clostridium sporogenes）〔CMCC（B）64 941〕

菌液制備 將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門菌分別接種於胰酪大豆腖液體培養基中或在胰酪大豆腖瓊脂培養基上，30～35℃培養18～24 小時；將白色念珠菌接種於沙氏葡萄糖瓊脂培養基上或沙氏葡萄糖液體培養基中，20～25℃培養2～3 天；將生孢梭菌接種於梭菌增菌培養基中置厭氧條件下30～35℃培養24～48 小時或接種於硫乙醇酸鹽流體培養基中30～35℃培養18～24 小時。上述培養物用pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液製成適宜濃度的菌懸液。

菌液制備後若在室溫下放置，應在2 小時內使用；若保存在2～8℃，可在24 小時內使用。生孢梭菌孢子懸液可替代新鮮的菌懸液，穩定的孢子懸液可保存在2～8℃，在驗證過的貯存期內使用。

陰性對照

為確認試驗條件是否符合要求，應進行陰性對照試驗， 陰性對照試驗應無菌生長。如陰性對照有菌生長，應進行偏差調查。

培養基適用性檢查

控制菌檢查用的成品培養基、由脫水培養基或按處方配製的培養基均應進行培養基的適用性檢查。

控制菌檢查用培養基的適用性檢查項目包括促生長能力、抑制能力及指示特性的檢查。各培養基的檢測項目及所用的菌株見表1。

表1 控制菌檢查用培養基的促生長能力、抑制能力和指示特性

液體培養基促生長能力檢查 分別接種不大於100cfu 的試驗菌（見表1）於被檢培養基和對照培養基中，在相應控制菌檢查規定的培養溫度及不長於規定的最短培養時間下培養，與對照培養基管比較，被檢培養基管試驗菌應生長良好。

固體培養基促生長能力檢查 用塗布法分別接種不大於100cfu 的試驗菌（見表1）於被檢培養基和對照培養基平板上，在相應控制菌檢查規定的培養溫度及不長於規定的最短培養時間下培養，被檢培養基與對照培養基上生長的菌落大小、形態特徵應一致。

培養基抑制能力檢查 接種不少於100cfu 的試驗菌（見表1）於被檢培養基和對照培養基中，在相應控制菌檢查規定的培養溫度及不短於規定的最長培養時間下培養，試驗菌應不得生長。

培養基指示特性檢查 用塗布法分別接種不大於100cfu 的試驗菌（見表1）於被檢培養基和對照培養基平板上，在相應控制菌檢查規定的培養溫度及不長於規定的最短培養時間下培養，被檢培養基上試驗菌生長的菌落大小、形態特徵、指示劑反應情況

㈨ 2015純化水微生物限度方法驗證要測定三次嗎

正常驗證都需要連續測三次，但是純化水的微生物檢驗應該是不需要做方法學驗證的啊？

㈩ 法莫替丁微生物限度檢查方法學驗證

2015版葯典微生物學擬收載情況

檢查法

①無菌檢查法

②非無菌葯品微生物計數法

③非無菌葯品控制菌檢查法

④抑菌劑效力檢查法

⑤滅菌法

⑥生物指示劑抗性檢查法

⑦中葯飲片的微生物限度檢查法

標准

非無菌葯品微生物限度標准

指導原則

非無菌葯品微生物限度檢查指導原則

制劑通則中

制劑通則中有關制劑項下的無菌和微生物限度檢查要求的修訂

制劑通則中有關制劑項下的[無菌]和[微生物限度]檢查要求的修訂

(1)為保證用葯安全，眼用液體、半固體制劑仍應符合無菌檢查法的規定

(2)為保證用葯安全，對用於手術、創傷、燒傷的外用制劑如鼻用制劑、軟膏劑、乳膏劑、噴霧劑、氣霧劑、凝膠劑、散劑、塗劑、滴耳劑等仍應符合無菌檢查的規定。但在其通則無菌檢查項下增加：「除另有規定外」。給予有不按無菌檢查的原因

(3)在搽劑和酊劑通則項下的微生物限度檢查項下增加：「除另有規定外」 。給予有可能需要按無菌檢查的原因

品種正文中的無菌或微生物限度檢查及其標准要求

1、受熱不穩定、制劑不能進行最終滅菌的無菌工藝產品如：抗生素原料葯、抗生素粉針劑正文中無菌檢查的規定

2、經驗證後各論化品種檢查項下的：無菌…..或微生物限度……(有具體檢查的規定)

3、葯用敷料的無菌或微生物限度要求及標准

4、純化水、注射用水的微生物限度要求及標准

2015年版葯典的純化水、注射用水[微生物限度]價差方法在參考歐、美葯典只要用水微生物檢查要求的基礎上，由浙江所立課題考察、比對，在所用培養基和方法上將有較大的修訂與USP35版、EP7.0版、JP16版比較，2015年版中國葯典微生物學檢驗體系規劃收載的項目和內容已基本趨向一致，將使我國葯典的微生物學檢驗成為一個比較完備的標准體系，其意義在於：

1）全面與國際葯典標准接軌；

2）從對終產品的檢驗向過程式控制制轉變。

2015年版微生物學檢驗中的重大修訂及意義

1、實驗環境的重大修訂

①無菌檢查環境潔凈度規定

②微生物限度檢查環境潔凈度規定

2、培養系統的重大修訂

①無菌檢查中培養基的修訂

②微生物計數法中培養基的修訂

③控制菌檢查法中培養基的修訂

④控制菌檢查法中培養基的修訂

⑤抑菌效力測定法中培養基的修訂

3、對一、二、三部微生物學附錄的整合、修訂

與USP35版、EP7.0版、JP16版比較，2015年版中國葯典微生物學檢驗體系規劃收載的項目和內容已基本趨向一致，將使我國葯典的微生物學檢驗成為一個比較完備的標准體系，其意義在於：

1）全面與國際葯典標准接軌；

2）從對終產品的檢驗向過程式控制制轉變。

培養基系統的重大修訂

修訂依據：

通過科研課題的建立及大量實驗，以國際品牌培養基為對照，考察了中國葯典微生物限度檢查法、無菌檢查法中所用國產培養基與USP/BP/JP中所規定的培養基的粗軍生長能力比較，得出大量的實驗數據，並經過可靠的統計分析名為整體微生物檢驗培養基的修訂提供了有利的技術支持。

修訂意義：

(1)糾正了我國在微生物檢驗系統中長期存在的對微生物分了培養的概念，提高污染微生物的檢查可能。

（2）與先進國家葯典所用培養基一致，為實現結果夫人打下重要基礎。

對一、二、三部微生物學附錄的整合、修訂

需進行整合、修訂的微生物學檢驗記錄：

①無菌檢查法

②微生物檢查法

③指導原則

微生物限度檢查法應用指導原則

葯品微生物實驗室規范指導原則

中國葯典2015年版微生物限度檢查法增、修訂

1、微生物限度檢查法收載形式的增、修訂

2、實驗環境的增、修訂

3、微生物計數法中的增、修訂

4、控制菌檢查法中的增、修訂

5、非無菌葯品微生物限度標準的整合、修訂

《中國葯典》2015年版微生物限度檢查法修訂後將分為三個附錄：

1、非無菌葯品微生物限度檢查：微生物計數法