微生物方法学验证2015

㈠ 微生物计数方法验证需要怎么准备

微生物限度检查方法学验证
1、供试品：XXXXX胶囊（批号：XXXXXX）
2、菌种：
菌落计数用菌种：
(1)
枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]
(2)
金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]
(3)
大肠埃希菌[CMCC（B）4]
(4)
白色念珠菌[CMCC
(F)
98001]
控制菌检查用菌种：
(1)
大肠埃希菌[CMCC（B）4]
(2)
金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]
3、培养基：营养肉汤培养基、改良马丁培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷培养基（MUG）。
4、预试验
按照中国药典2005年版微生物限度检查法中常规法及培养基稀释法检验，金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的回收率均小于70%，本品有抑菌作用。
5、细菌、霉菌及酵母菌计数
按照中国药典2005年版微生物限度检查法进行细菌、霉菌及酵母菌计数的方法学验证试验及菌落计数。
5.1菌液制备：
(1)
接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤中，35～37℃培养18～24小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7，使菌数约为50～100cfu/ml。
(2)
接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7，使菌数约为50～100cfu/ml。
5.2
供试液的制备
取供试品10g，pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇，使呈1：10的供试品储备液。取1：10的供试品储备液
10ml

㈡ 微生物方法学验证验证结果怎么填写

微生物限度检查方法学验证

1、供试品：XXXXX胶囊（批号：XXXXXX）

2、菌种：

菌落计数用菌种：

(1) 枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]

(2) 金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]

(3) 大肠埃希菌[CMCC（B）4]

(4) 白色念珠菌[CMCC (F) 98001]

控制菌检查用菌种：

(1) 大肠埃希菌[CMCC（B）4]

(2) 金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]

3、培养基：营养肉汤培养基、改良马丁培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷培养基（MUG）。

4、预试验 按照中国药典2005年版微生物限度检查法中常规法及培养基稀释法检验，金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的回收率均小于70%，本品有抑菌作用。

5、细菌、霉菌及酵母菌计数

按照中国药典2005年版微生物限度检查法进行细菌、霉菌及酵母菌计数的方法学验证试验及菌落计数。

5.1菌液制备：

(1) 接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤中，35～37℃培养18～24小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7，使菌数约为50～100cfu/ml。

(2) 接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7，使菌数约为50～100cfu/ml。

5.2 供试液的制备 取供试品10g，pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇，使呈1：10的供试品储备液。取1：10的供试品储备液 10ml

㈢ 在2015版微生物限度检查法的验证中，验证实验用菌种有哪几种

药品微生物限度检查是控制药品质量的一个重要检查项目。中国药典2005年版规定，不同的药品微生物限度检查中的细菌数、霉菌及酵母菌数测定、各控制菌的检查，必须按照经过验证的方法进行。一些中西药制剂由于药品本身的理化性质及抑菌活性，干扰药品污染的微生物计数测定和控制菌的检出，带来检查结果的不准确性。如在细菌数测定中，低稀释级的平均平板菌落数低于高稀释级，呈现细菌的不正常分布，即药品显现出干扰或抑菌作用；反映在控制菌检查中，阳性对照试验呈阴性反应，其检验结果不能反映药品被微生物污染的真实状况，得出不准确的结果或假阴性结果。由于2005年版以前的中国药典，没有要求对微生物限度检查中的各项目进行方法学验证，以至于这类方法学问题越来越多，影响微生物限度检查结果的准确性。2002年10月～2003年4月我所参加中检所组织药品微生物限度检查方法验证试验协作课题。选择了4种审核检验的中西药制剂品种，其原药品标准没有进行微生物限度检查方法验证考察，也未见相关文献报道。为对微生物限度检查方法进行考察，选用4种代表菌做了微生物计数的菌回收率试验。根据各品种的要求对控制菌做检出率测定的研究。得出的结果说明这些药品微生物限度检查方法存在的问题，并为该课题提供了试验数据。

㈣ 微生物方法学验证需要三批样品吗

通常情况就是在其他项目进行检验的同时，进行微生物的方法学研究，然后三批样品微生物全检。既然是微生物检查，那就要求样品是在车间生产的，有一定的环境控制条件下生成的样品，普通实验室样品是达不到要求的。

㈤ 微生物限度检查方法应该说是“验证”还是“确认”

微生物限度检查方法应该说是“验证”还是“确认”
药品微生物限度检查是控制药品质量的一个重要检查项目。中国药典2005年版规定，不同的药品微生物限度检查中的细菌数、霉菌及酵母菌数测定、各控制菌的检查，必须按照经过验证的方法进行。一些中西药制剂由于药品本身的理化性质及抑菌活性，干扰药品污染的微生物计数测定和控制菌的检出，带来检查结果的不准确性。如在细菌数测定中，低稀释级的平均平板菌落数低于高稀释级，呈现细菌的不正常分布，即药品显现出干扰或抑菌作用；反映在控制菌检查中，阳性对照试验呈阴性反应，其检验结果不能反映药品被微生物污染的真实状况，得出不准确的结果或假阴性结果。由于2005年版以前的中国药典，没有要求对微生物限度检查中的各项目进行方法学验证，以至于这类方法学问题越来越多，影响微生物限度检查结果的准确性。2002年10月～2003年4月我所参加中检所组织药品微生物限度检查方法验证试验协作课题。选择了4种审核检验的中西药制剂品种，其原药品标准没有进行微生物限度检查方法验证考察，也未见相关文献报道。为对微生物限度检查方法进行考察，选用4种代表菌做了微生物计数的菌回收率试验。根据各品种的要求对控制菌做检出率测定的研究。得出的结果说明这些药品微生物限度检查方法存在的问题，并为该课题提供了试验数据。

㈥ 原料药工艺改变需重新进行微生物方法学验证吗

微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法.检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查. 微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度 100级的单向流空气区域内进行.检验全过程必须严格遵守无菌操作,防止再污染,防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出.单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证. 供试品检查时,如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂,应证明其有效性及对微生物无毒性. 除另有规定外,本检查法中细菌及控制菌培养温度为30℃～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23℃～28℃. 检验结果以 1g、1ml、10g、10ml或10cm2 为单位报告,特殊品种可以最小包装单位报告. 检验量检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml 或cm2）. 除另有规定外,一般供试品的检验量为10g 或10ml；膜剂为100cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减.要求检查沙门菌的供试品,其检验量应增加20g 或20ml（其中10g或10ml用于阳性对照试验）. 检验时,应从2 个以上最小包装单位中抽取供试品,膜剂还不得少于4 片. 一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的3 倍量供试品. 供试液的制备根据供试品的理化特性与生物学特性,采取适宜的方法制备供试液.供试液制备若需加温时,应均匀加热,且温度不应超过45℃.供试液从制备至加入检验用培养基,不得超过1 小时. 除另有规定外,常用的供试液制备方法如下. 1.液体供试品取供试品10ml,加pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,混匀,作为1∶10 的供试液.油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80 使供试品分散均匀.水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液. 2.固体、半固体或黏稠性供试品取供试品10g,加pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,用匀浆仪或其他适宜的方法,混匀,作为1∶10 的供试液.必要时加适量的无菌聚山梨酯80,并置水浴中适当加温使供试品分散均匀. 3.需用特殊供试液制备方法的供试品 (1)非水溶性供试品方法1 取供试品5g（或5ml）,加至含溶化的（温度不超过45℃）5g 司盘80、3g 单硬脂酸甘油酯、10g 聚山梨酯80 无菌混合物的烧杯中,用无菌玻棒搅拌成团后,慢慢加入45℃的pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,边加边搅拌,使供试品充分乳化,作为1∶20 的供试液. 方法2 取供试品10g,加至含20ml 无菌十四烷酸异丙酯（采用薄膜过滤法过滤除菌.选用孔径为0.22μm的脂溶性滤膜,在140℃干热灭菌2小时）和无菌玻璃珠的适宜容器中,必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量,充分振摇,使供试品溶解.然后加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml,振摇5～10 分钟,萃取,静置使油水明显分层,取其水层作为1∶10 的供试液. (2)膜剂供试品取供试品100cm2,剪碎,加100ml 的pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（必要时可增加稀释液）,浸泡,振摇,作为1∶10 的供试液. (3)肠溶及结肠溶制剂供试品取供试品10g,加pH6.8 无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）或pH7.6 无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）至100ml,置45℃水浴中,振摇,使溶解,作为1∶10 的供试液. (4)气雾剂、喷雾剂供试品取规定量供试品,置冰冻室冷冻约1 小时,取出,迅速消毒供试品开启部位,用无菌钢锥在该部位钻一小孔,放至室温,并轻轻转动容器,使抛射剂缓缓全部释出.用无菌注射器吸出全部药液,加至适量的pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（若含非水溶性成分,加适量的无菌聚山梨酯80）中,混匀,取相当于10g或10ml 的供试品,再稀释成1∶10 的供试液. (5)贴剂供试品取规定量供试品,去掉贴剂的保护层,放置在无菌玻璃或塑料片上,粘贴面朝上.用适宜的无菌多孔材料（如无菌纱布）覆盖贴剂的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起.然后将其置于适宜体积并含有表面活性剂（如聚山梨酯80 或卵磷脂）的稀释剂中,用力振荡至少30 分钟,制成供试液.贴剂也可以其他适宜的方法制备成供试液. (6)具抑菌活性的供试品当供试品有抑菌活性时,采用下列方法进行处理,以消除供试液的抑菌活性后,再依法检查.常用的方法如下. ①培养基稀释法 取规定量的供试液,至较大量的培养基中,使单位体积内的供试品含量减少,至不含抑菌作用.测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时,取同稀释级的供试液2ml,每1ml 供试液可等量分注多个平皿,倾注琼脂培养基,混匀,凝固,培养,计数.每1ml 供试液所注的平皿中生长的菌数之和即为1ml的菌落数,计算每1ml 供试液的平均菌落数,按平皿法计数规则报告菌数；控制菌检查时,可加大增菌培养基的用量. ②离心沉淀法 取一定量的供试液, 500 转/分钟离心3 分钟,取全部上清液混合,用于细菌检查. ③薄膜过滤法 见细菌、霉菌及酵母菌计数项下的“薄膜过滤法”. ④中和法 凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品,可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分.中和剂或灭活剂可加在所用的稀释液或培养基中. 细菌、霉菌及酵母菌计数计数培养基的适用性检查细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的适用性检查,成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基均应检查. 菌种 试验用菌株的传代次数不得超过5 代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0 代）.并采用适宜的菌种保藏技术进行保存,以保证试验菌株的生物学特性. 大肠埃希菌（Escherichia coli）〔CMCC（B） 44 102〕金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）〔CMCC（B） 26 003〕枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B） 63 501〕白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC（F） 98 001〕黑曲霉（Aspergillus niger）〔CMCC（F） 98 003〕菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中,培养18～24 小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中,培养24～48 小时.上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数为50～100cfu 的菌悬液.接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中,培养5～7 天,加入3～5ml 含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80 的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱.然后,采用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内,用含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80 的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含孢子数50～100cfu 的孢子悬液. 菌悬液在室温下放置应在2 小时内使用,若保存在2～8℃可在24 小时内使用.黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃,在验证过的贮存期内使用. 适用性检查 取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各50～100cfu,分别注入无菌平皿中,立即倾注营养琼脂培养基,每株试验菌平行制备2 个平皿,混匀,凝固,置30～35℃培养48 小时,计数；取白色念珠菌、黑曲霉各50～100cfu,分别注入无菌平皿中,立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基,每株试验菌平行制备2个平皿,混匀,凝固,置23～28℃培养72 小时,计数；取白色念珠菌50～100cfu,注入无菌平皿中,立即倾注酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基,平行制备2 个平皿,混匀,凝固,置23～28℃培养72 小时,计数.同时,用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验. 结果判定 被检培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值大于70%,且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致,判该培养基的适用性检查符合规定. 计数方法的验证当建立产品的微生物限度检查法时,应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证,以确认所采用的方法适合于该产品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定.若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时,计数方法应重新验证. 验证时,按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行.对各试验菌的回收率应逐一进行验证. 菌种及菌液制备 同计数培养基的适用性检查. 验证方法 验证试验至少应进行3 次独立的平行试验,并分别计算各试验菌每次试验的回收率. （1）试验组 平皿法计数时,取试验可能用的最低稀释级供试液1ml 和50～100 cfu 试验菌,分别注入平皿中,立即倾注琼脂培养基,每株试验菌平行制备2个平皿,按平皿法测定其菌数.薄膜过滤法计数时,取规定量试验可能用的最低稀释级供试液,过滤,冲洗,在最后一次的冲洗液中加入50～100cfu 试验菌,过滤,按薄膜过滤法测定其菌数. （2）菌液组 测定所加的试验菌数. （3）供试品对照组 取规定量供试液,按菌落计数方法测定供试品本底菌数. （4）稀释剂对照组 若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时,应增加稀释剂对照组,以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度.试验时,可用相应的稀释液替代供试品,加入试验菌,使最终菌浓度为每1ml 供试液含50～100cfu,按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数. 结果判断 在3 次独立的平行试验中,稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%.若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%,照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%,应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法（表1）等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性,并重新进行方法验证. 表1 常见干扰物的中和剂或灭活方法干扰物 可选用的中和剂或灭活方法 戊二醛 亚硫酸氢钠 酚类、乙醇、吸附物 稀释法 醛类 稀释法、甘氨酸、硫代硫酸盐 季铵类化合物（QACs）、对羟基苯甲酸酯 卵磷脂、聚山梨酯 汞类制剂 亚硫酸氢纳、巯基乙酸盐、硫代硫酸盐 双胍类化合物 卵磷脂 干扰物 可选用的中和剂或灭活方法 干扰物 可选用的中和剂或灭活方法 卤化物 硫代硫酸盐 乙二胺四乙酸（EDTA） 镁或钙离子 磺胺类 对氨基苯甲酸 ?-内酰胺类抗生素 ?-内酰胺酶 若没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用,那么验证试验中微生物回收的失败可看成是因供试品的抗菌活性引起的,同时表明该供试品不能被试验菌污染.但是,供试品也可能仅对试验用菌株具有抑制作用,而对其他菌株没有抑制作用.因此,根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则,在不影响检验结果判断的前提 下,应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行方法验证试验.若验证试验符合要求,应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检验. 计数方法验证时,采用上述方法若还存在一株或多株试验菌的回收率达不到要求,那么选择回收情况最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检验. 验证试验也可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行. 供试品检查计数方法包括平皿法和薄膜过滤法.检查时,按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定. 按计数方法的验证试验确认的程序进行供试液制备.用稀释液稀释成1∶10、1∶102、1∶103等稀释级的供试液. 1.平皿法根据菌数报告规则取相应稀释级的供试液1ml,置直径90mm 的无菌平皿中,注入15～20ml 温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基,混匀,凝固,倒置培养.每稀释级每种培养基至少制备2 个平板. 阴性对照试验 取试验用的稀释液1ml,置无菌平皿中,注入培养基,凝固,倒置培养.每种计数用的培养基各制备2 个平板,均不得有菌生长. 培养和计数 除另有规定外,细菌培养3 天,霉菌、酵母菌培养5 天.逐日观察菌落生长情况；点计菌落数.必要时,可适当延长培养时间至7 天进行菌落计数并报告.菌落蔓延生长成片的平板不宜计数.点计菌落数后,计算各稀释级供试液的平均菌落数,按菌数报告规则报告菌数.若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15,则两个平板的菌落数不能相差1 倍或以上. 一般营养琼脂培养基用于细菌计数；玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数.在特殊情况下,若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌,则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数.然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数,与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较,以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果. 含蜂蜜、王浆的液体制剂,用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数,用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数,合并计数. 菌数报告规则 细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于300cfu、霉菌宜选取平均菌落数小于100cfu 的稀释级,作为菌数报告（取两位有效数字）的依据.以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g、1mL 或10cm2 供试品中所含的菌数. 如各稀释级的平板均无菌落生长,或仅最低稀释级的平板有菌落生长,但平均菌落数小于1 时,以＜1 乘以最低稀释倍数的值报告菌数. 2.薄膜过滤法采用薄膜过滤法,滤膜孔径应不大于0.45μm,直径一般为50mm,若采用其它直径的滤膜,冲洗量应进行相应的调整.选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留.滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌.使用时,应保证滤膜在过滤前后的完整性.水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜.油类供试品,其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥.为发挥滤膜的最大过滤效率,应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面.供试液经薄膜过滤后,若需要用冲洗液冲洗滤膜,每张滤膜每次冲洗量不超过100ml,总冲洗量不得超过1000ml,以避免滤膜上的微生物受损伤. 取相当于每张滤膜含1g、1ml 或10cm2 供试品的供试液,加至适量的稀释剂中,混匀,过滤；若供试品每1g、1ml 或10cm2 所含的菌数较多时,可取适宜稀释级的供试液1ml 进行试验.用pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜,冲洗方法和冲洗量同“计数方法的验证”.冲洗后取出滤膜,菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养.每种培养基至少制备一张滤膜. 阴性对照试验 取试验用的稀释液1ml 照上述薄膜过滤法操作,作为阴性对照.阴性对照不得有菌生长. 培养和计数 培养条件和计数方法同平皿法,每片滤膜上的菌落数应不超过100 个. 菌数报告规则 以相当于1g、1ml 或10cm2 供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长,以

㈦ 2015年版陈香露白露片微生物方法学验证用什么方法

陈香露白露片药物是一复方中成药制剂，由川木香、大黄、石菖蒲、陈皮、甘草、次硝酸铋、氧化镁、碳酸氢钠组成，用于胃溃疡、糜烂性胃炎、胃酸过多等疾病。
建立陈香露白露片药物微生物限度检查方法。方法：根据该样品的微生物限度标准，按《中国药典》2005年版一部附录微生物限度检查法的验证试验指导原则，用委托厂家3个批号的陈香露白露片药物进行验证试验，以考察确定陈香露白露片药物微生物限度的检查方法。首先用常规法进行预试验，初步考察该样品对试验菌检测的影响，然后根据预试验结果，用离心沉淀集菌法进行再试验。结果：常规法试验时，大肠埃希菌、白色念珠菌的回收率均大于70%，而金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的回收率小于70%，控制菌检查检出试验菌。采用离心沉淀集菌法试验时，可以有效消除抑菌作用，使金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的回收率大于70%。结论：采用离心沉淀集菌法可以有效消除抑菌作用，简便、准确。

㈧ 15版微生物限度方法学适用性

非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法-2015中国药典
控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。

当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料是否符合相应的微生物限度标准时，应按下列规定进行检验，包括样品取样量和结果判断等。

本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。

供试液制备及实验环境要求同“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”（通则1105）。

如果供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认有效性及对微生物无毒性。

供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。

培养基适用性检查和控制菌检查方法适用性试验

供试品控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。

供试品的控制菌检查方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查。

若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，控制菌检查方法应重新进行适用性试验。

菌种及菌液制备

菌种 试验用菌株的传代次数不得超过5 代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC（B）26 003〕

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)〔CMCC（B）10 104〕

大肠埃希菌(Escherichia coli)〔CMCC（B）44 102〕

乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)〔CMCC（B）50 094〕

白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC（F）98 001〕

生孢梭菌（Clostridium sporogenes）〔CMCC（B）64 941〕

菌液制备 将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中或在胰酪大豆胨琼脂培养基上，30～35℃培养18～24 小时；将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上或沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养2～3 天；将生孢梭菌接种于梭菌增菌培养基中置厌氧条件下30～35℃培养24～48 小时或接种于硫乙醇酸盐流体培养基中30～35℃培养18～24 小时。上述培养物用pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液。

菌液制备后若在室温下放置，应在2 小时内使用；若保存在2～8℃，可在24 小时内使用。生孢梭菌孢子悬液可替代新鲜的菌悬液，稳定的孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。

阴性对照

为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验， 阴性对照试验应无菌生长。如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。

培养基适用性检查

控制菌检查用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基的适用性检查。

控制菌检查用培养基的适用性检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示特性的检查。各培养基的检测项目及所用的菌株见表1。

表1 控制菌检查用培养基的促生长能力、抑制能力和指示特性

液体培养基促生长能力检查 分别接种不大于100cfu 的试验菌（见表1）于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及不长于规定的最短培养时间下培养，与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。

固体培养基促生长能力检查 用涂布法分别接种不大于100cfu 的试验菌（见表1）于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及不长于规定的最短培养时间下培养，被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。

培养基抑制能力检查 接种不少于100cfu 的试验菌（见表1）于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及不短于规定的最长培养时间下培养，试验菌应不得生长。

培养基指示特性检查 用涂布法分别接种不大于100cfu 的试验菌（见表1）于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及不长于规定的最短培养时间下培养，被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况

㈨ 2015纯化水微生物限度方法验证要测定三次吗

正常验证都需要连续测三次，但是纯化水的微生物检验应该是不需要做方法学验证的啊？

㈩ 法莫替丁微生物限度检查方法学验证

2015版药典微生物学拟收载情况

检查法

①无菌检查法

②非无菌药品微生物计数法

③非无菌药品控制菌检查法

④抑菌剂效力检查法

⑤灭菌法

⑥生物指示剂抗性检查法

⑦中药饮片的微生物限度检查法

标准

非无菌药品微生物限度标准

指导原则

非无菌药品微生物限度检查指导原则

制剂通则中

制剂通则中有关制剂项下的无菌和微生物限度检查要求的修订

制剂通则中有关制剂项下的[无菌]和[微生物限度]检查要求的修订

(1)为保证用药安全，眼用液体、半固体制剂仍应符合无菌检查法的规定

(2)为保证用药安全，对用于手术、创伤、烧伤的外用制剂如鼻用制剂、软膏剂、乳膏剂、喷雾剂、气雾剂、凝胶剂、散剂、涂剂、滴耳剂等仍应符合无菌检查的规定。但在其通则无菌检查项下增加：“除另有规定外”。给予有不按无菌检查的原因

(3)在搽剂和酊剂通则项下的微生物限度检查项下增加：“除另有规定外” 。给予有可能需要按无菌检查的原因

品种正文中的无菌或微生物限度检查及其标准要求

1、受热不稳定、制剂不能进行最终灭菌的无菌工艺产品如：抗生素原料药、抗生素粉针剂正文中无菌检查的规定

2、经验证后各论化品种检查项下的：无菌…..或微生物限度……(有具体检查的规定)

3、药用敷料的无菌或微生物限度要求及标准

4、纯化水、注射用水的微生物限度要求及标准

2015年版药典的纯化水、注射用水[微生物限度]价差方法在参考欧、美药典只要用水微生物检查要求的基础上，由浙江所立课题考察、比对，在所用培养基和方法上将有较大的修订与USP35版、EP7.0版、JP16版比较，2015年版中国药典微生物学检验体系规划收载的项目和内容已基本趋向一致，将使我国药典的微生物学检验成为一个比较完备的标准体系，其意义在于：

1）全面与国际药典标准接轨；

2）从对终产品的检验向过程控制转变。

2015年版微生物学检验中的重大修订及意义

1、实验环境的重大修订

①无菌检查环境洁净度规定

②微生物限度检查环境洁净度规定

2、培养系统的重大修订

①无菌检查中培养基的修订

②微生物计数法中培养基的修订

③控制菌检查法中培养基的修订

④控制菌检查法中培养基的修订

⑤抑菌效力测定法中培养基的修订

3、对一、二、三部微生物学附录的整合、修订

与USP35版、EP7.0版、JP16版比较，2015年版中国药典微生物学检验体系规划收载的项目和内容已基本趋向一致，将使我国药典的微生物学检验成为一个比较完备的标准体系，其意义在于：

1）全面与国际药典标准接轨；

2）从对终产品的检验向过程控制转变。

培养基系统的重大修订

修订依据：

通过科研课题的建立及大量实验，以国际品牌培养基为对照，考察了中国药典微生物限度检查法、无菌检查法中所用国产培养基与USP/BP/JP中所规定的培养基的粗军生长能力比较，得出大量的实验数据，并经过可靠的统计分析名为整体微生物检验培养基的修订提供了有利的技术支持。

修订意义：

(1)纠正了我国在微生物检验系统中长期存在的对微生物分了培养的概念，提高污染微生物的检查可能。

（2）与先进国家药典所用培养基一致，为实现结果夫人打下重要基础。

对一、二、三部微生物学附录的整合、修订

需进行整合、修订的微生物学检验记录：

①无菌检查法

②微生物检查法

③指导原则

微生物限度检查法应用指导原则

药品微生物实验室规范指导原则

中国药典2015年版微生物限度检查法增、修订

1、微生物限度检查法收载形式的增、修订

2、实验环境的增、修订

3、微生物计数法中的增、修订

4、控制菌检查法中的增、修订

5、非无菌药品微生物限度标准的整合、修订

《中国药典》2015年版微生物限度检查法修订后将分为三个附录：

1、非无菌药品微生物限度检查：微生物计数法